با عنوان : مطالعه باکتری سالمونلا تیفی در سالاد به وسیله روش LAMP-PCR

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده: علوم پایه، گروه زیست شناسی
پایان¬نامۀ کارشناسی ارشد (M.Sc)
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان
مطالعه باکتری سالمونلا تیفی در سالاد به وسیله روش LAMP-PCR
استاد راهنما:
دكتر مجید مقبلی حسين آبادي
استاد مشاور:
دكتر هاتف آجوداني فر

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل می باشد)

   عنوان                                                                                                                   صفحه    

         چکیدۀ فارسی …………………………………………………………………………………………………………………………….12

فصل اول: مقدمه (اهداف پژوهش) ………………………………………………………………………………………………….13

اهداف پژوهش در نگاه اجمالی………………………………………………………………………………………………………..16

فصل دوم: كليات (سابقه و پیشینۀ پژوهش)……………………………………………………………………………………..17

1-2- مشخصات جنس سالمونلا……………………………………………………………………………………………………18

1-1-2- تاريخچه………………………………………………………………………………………………………………………18

2-1-2- خواص شكلي…………………………………………………………………………………………………………….. 19

3-1-2- خواص بيوشيميايي………………………………………………………………………………………………………..19

4-1-2-مقاومت در برابر عوامل فيزيكي و شيمياي…………………………………………………………………………..20

5-1-2- خواص كشت…………………………………………………………………………………………………………………20

6-1-2 شرايط رشد سالمونلاها……………………………………………………………………………………………………..21

7-1-2- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………………………22

8-1-2- زيستگاه…………………………………………………………………………………………………………………………23

2-2- تاكسونومي…………………………………………………………………………………………………………………………23

1-2-2- سالمونلا تيفي…………………………………………………………………………………………………………………26

2-2-2- سالمونلا انتريتيديس………………………………………………………………………………………………………..26

3-2-2- سالمونلا كلراسوئيس……………………………………………………………………………………………………….27

4-2-2- سالمونلا پولوروم…………………………………………………………………………………………………………….28

5-2-2- سالمونلا گاليناروم…………………………………………………………………………………………………………..28

6-2-2- سالمونلا آريزونا……………………………………………………………………………………………………………..29

7-2-2- ساختمان آنتی­ژني………………………………………………………………………………………………………….31

8-2-2- طبقه بندي سالمونلا به مقصود اهداف اپيدميولوژيكي………………………………………………………….32

1-8-2-2- ارگانيسم­هاي موجب عفونت در بشر ………………………………………………………………………..32

2-8-2-2- واريته هاي سرولوژيكي سازگار با ميزبان………………………………………………………………………32

3-8-2-2- واريته هاي سرولوژيكي ناسازگار…………………………………………………………………………………33

3-2- شاخص­هاي بيماري­زايي……………………………………………………………………………………………………..33

1-3-2- آنتي­ژن­هاي سطحي………………………………………………………………………………………………………..33

2-3-2-تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………….33

3-3-2- اندو­توكسين انترو­توكسين سيتو­توكسين …………………………………………………………………………….34

4-2- بيماري­زايي و مكانيسم آن……………………………………………………………………………………………………34

1-4-2- طریقه بيماري­زايي……………………………………………………………………………………………………………35

2-4-2- ميزان شيوع سالمونلوز در بشر……………………………………………………………………………………….35

3-4-2- عفونت­های سالمونلایی در بشر……………………………………………………………………………………..36

1-3-4-2- تب تيفوئيد و تب­هاي روده­اي……………………………………………………………………………………..36

2-3-4-2- سپتي­سمي…………………………………………………………………………………………………………………37

3-3-4-2- گاسترو­انتريت…………………………………………………………………………………………………………….37

4-4-2- علائم باليني در بشر……………………………………………………………………………………………………..37

5-2- اپيدميولوژي……………………………………………………………………………………………………………………….38

6-2- روش­هاي تشخيص…………………………………………………………………………………………………………….40

1-6-2- روش­هاي فنوتيپي…………………………………………………………………………………………………………..41

1-1-6-2- بيوتايپينگ………………………………………………………………………………………………………………..41

2-1-6-2- سروتايپينگ……………………………………………………………………………………………………………….42

3-1-6-2- روش­هاي ايمنولوژيك………………………………………………………………………………………………..42

1-3-1-6-2- الايزا…………………………………………………………………………………………………………………….43

2-3-1-6-2- IMS…………………………………………………………………………………………………………………..44

2-6-2- روش­هاي ژنوتيپي………………………………………………………………………………………………………….44

1-2-6-2- روش واكنش زنجيره ايي پليمراز PCR)) …………………………………………………………………. 45

2-2-6-2- multiplex PCR……………………………………………………………………………………………………47

3-2-6-2- real-time PCR……………………………………………………………………………………………..47

4-2-6-2- روش تکثير هم دمای وابسته به حلقه LAMP………………………………………………………………48

1-4-2-6-2- پرايمرهاي LAMP………………………………………………………………………………………………..49

2-4-2-6-2- مكانيسم واكنش LAMP……………………………………………………………………………………….51

3-4-2-6-2- مشخصات روش LAMP………………………………………………………………………………………56

4-4-2-6-2- مواد لازم برای انجام واکنش LAMP………………………………………………………………………57

5-4-2-6-2- ارزيابي محصولات LAMP……………………………………………………………………………………60

6-4-2-6-2- مكانيسم تشكيل كدورت در واكنش LAMP…………………………………………………………….61

7-4-2-6-2- مزاياي روش LAMP…………………………………………………………………………………………….62

7-2 مطالعات آزمايشگاهي…………………………………………………………………………………………………………….63

1-7-2- مطالعه بر روي سويه­هاي سالمونلا به روش الايزا……………………………………………………………….63

2-7-2- مطالعه بر روي سويه­هاي سالمونلا به روش PCR………………………………………………………………65

3-7-2- مطالعه بر روي سويه­هاي سالمونلا به روش LAMP…………………………………………………………..70

فصل سوم (مواد و روش ها)…………………………………………………………………………………………………………75

1-3 وسایل مورد بهره گیری………………………………………………………………………………………………………………76

2-3- مواد مورد بهره گیری ………………………………………………………………………………………………………………77

3-3- رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………………………………………..79

4-3- تستهاي بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………………79

1-4-3- تست سيمون سيترات…………………………………………………………………………………………………….81

2-4-3- تست تریپل شوگر ایرون آگار(TSI) ………………………………………………………………………………81

3-4-3- تست SIM…………………………………………………………………………………………………………………82

4-4-3- تست اوره …………………………………………………………………………………………………………………..82

5-3- روش تهیۀ گلسیرول استوک از باکتری­ مورد نظر…………………………………………………………………..83

6-3- روش استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………..83

1-6-3- طرز تهیۀ محلول­های مورد نیاز برای استخراج DNA………………………………………………………..84

2-6-3- مراحل استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………84

7-3- تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر……………………………………………………………………….86

8-3- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………..87

1-8-3- طرز تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………88

2-8-3- طرز تهیۀ بافر (1X)TBE……………………………………………………………………………………………….88

9-3- واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………89

1-9-3- اجزا واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………….91

2-9-3- روش انجام واکنش PCR با آنزیم SmarTaq DNA Polymerase……………………………….93

10-3- واکنش LAMP………………………………………………………………………………………………………………94

1-10-3- روش انجام واکنشLAMP …………………………………………………………………………………………95

11-3- آلوده سازي سس مايونز با باكتري مورد نظر………………………………………………………………………..96

12-3- آلوده سازي سالاد سبزيجات با باكتري مورد نظر…………………………………………………………………..97

13-3- تهيه پورپليت و شمارش باكتري­ها………………………………………………………………………………………98

1-13-3 تهيه رقت……………………………………………………………………………………………………………………..98

2-14-3- کشت سطحی………………………………………………………………………………………………………………99

2-14-3- کشت پورپلیت…………………………………………………………………………………………………………….99

3-13-3 شمارش باكتري­ها…………………………………………………………………………………………………………..99

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………100

1-4- رنگ آميزي گرم از باكتري……………………………………………………………………………………………….101

2-4- نتایج کشت نمونه ها روي محیط اختصاصي shigella– salmonella agar………………………101

2-4- تست­هاي بيوشيميايي……………………………………………………………………………………………………..102

1-3-4- تست اوره………………………………………………………………………………………………………………….102

2-3-4- تست سيمون سيترات…………………………………………………………………………………………………..103

3-3-4 تست TSI ……………………………………………………………………………………………………………………104

4-3-4 تست SIM……………………………………………………………………………………………………………………105

5-3-4 تست متيل رد ……………………………………………………………………………………………………………….106

4-4- استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………………….107

5-4- PCR………………………………………………………………………………………………………………………………108

1-5-4- حد تشخيص PCR………………………………………………………………………………………………………109

6-4- LAMP ……………………………………………………………………………………………………………………….110

1-6-4 حد تشخيص LAMP………………………………………………………………………………………………….112

فصل پنجم (بحث)……………………………………………………………………………………………………………………113

نتيجه­گيري………………………………………………………………………………………………………………………………..121

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………..122

چكيده

سالمونلا باكتري گرم منفي، متحرك و باسيلي شكل می باشد كه خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را دارا مي‌باشد. سالمونلا و سروتيپ‌هاي آن منبع مهم آلودگي غذاهاي انساني و عامل پاتوژن بسيار قوي و بيماري­زا در بشر­هاست. امروزه بيش از 2450 سروتيپ سالمونلا شناسايي شده می باشد كه برخي از اين سروتيپ‌ها عامل بيماري‌هايي از قبيل تب تيفوئيد و انتروكوليك در بشر مي‌باشند. بیماری­هاي ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهاي در حال توسعه مانند کشور ما می باشد. پس تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن براي جلوگیري از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتري ضروري به­نظر مي­رسد.

روش­هاي مختلفي براي جداسازي باكتري سالمونلا از نمونه‌هاي محيطي هست كه شامل: روش‌هاي كشت سنتي و بيوشيميايي، سرولوژيكي و مولكولي (مانند PCR) می باشد. تمام این روش­ها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتري در نمونه اولیه، تجهیزات گران­قیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.

هدف از این مطالعه مطالعه کارایی روش جدید تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی می­باشد. مطالعه نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشي سريع، ارزان و اختصاصی می باشد و به­جاي دستگاه­هاي گران­قیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با بهره گیری از یک بلوك حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دماي واحد 60 درجه سانتي­گراد و همچنين نظاره کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژن­ها در زمان كوتاه­تري به تشخیص اختصاصی این باكتري سالمونلا پرداخت.

این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با كاربرد گسترده در آزمایشگاه­هاي تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاه­هاي مناطق محروم و آزمايشگاه­هاي سيار مورد بهره گیری قرار گیرد.

واژه هاي کلیدي : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

مقدمه

اعضاي جنس سالمونلا، باكتري گرم منفي، ميله­ايي، بي­هوازي اختياري و بدون اسپور هستند. از آنجا كه جايگاه اصلي و طبيعي اين باكتري‌ها روده بشر و حيوانات مي‌باشد اصطلاحاً آنها را باسيل‌هاي روده‌اي يا انتريك مي‌نامند. از لحاظ شرايط رشد اين ميكروارگانيسم‌ها باكتري‌هاي انعطاف‌پذيري بوده و به آساني با شرايط محيطي خود را متناسب مي‌كنند اين جنس از ميكروارگانيسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌هاي پائين امكان بقاي آنها بيشتر می باشد .(Connie & Manuselis, 2000)

     اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا پاتوژن‌هاي بالقوه براي بشر و بسياري از حيوانات مي‌باشند. اين باكتري‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهي‌ها سيطره پيدا كرده، بسته به سروتيپ، شرايط و عوامل متعدد ميزباني، بيماري­هايي با نشانه‌هاي گوناگون و عوارض متفاوت ايجاد مي‌كنند .(Merchant & Pocker, 1983)مانند باكتري­هاي روده­ايي­ هستند كه موجب بيماري تب تيفوئيد(حصبه)، تب شبه حصبه و بيماري­هاي ناشي از مواد غذائي در بشر مي­گردند(Jay et al., 2005).

     بيماري­هاي ناشي از آلودگي مواد غذائي ناشي از سالمونلا را non typhoidal ناميده­اند. سالمونلا به­گونه گسترده­­ايي در محيط زيست از قبيل آب، خاك و مدفوع حيوانات توزيع شده می باشد (Cidrp, 2009). باكتري معمولاً از طريق مدفوع بشر و يا دام دفع شده و باعث آلودگي آب و غذا و محيط مي‌گردد. مواد غذائي مانند گوشت، تخم­مرغ، مرغ، سس مايونز، سبزيجات و غيره ،از ناقل­هاي اوليه عفونت سالمونلا به بشر هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..

   سالمونلاي غير­تيفوئيدي علت اصلي بيماري­هاي ناشي از مواد غذائي در سراسر جهان می باشد. كه بر­آورد شده كه حدود 4/1 ميليون مورد در سال مورد عفونت غذائي سالمونلا قرار مي­گيرند(Mead et al., 1999).

از اين­رو شناخت و تشخيص به موقع سالمونلا از اهميت خاصي برخوردار می باشد. با ذكر تمامي اين موارد به نظر مي‌رسد تشخيص به موقع و كنترل باكتري از وظايف مهم آزمايشگاه‌هاي ميكروب‌شناسي می باشد. امروزه از 3 روش رايج به تشخيص باكتري مي‌پردازند:

ـ روش‌هاي كشت سنتي و آزمايشات بيوشيميايي.

ـ روش‌هاي سرولوژيكي.

ـ روش‌هاي مولكولي.

     براي تشخيص بهره گیری از روش­هاي سنتي مبتني بر محيط كشت قابل قبول می باشد ولي وقت­گير می باشد و براي تاييد جواب نهايي چند روز به­طول مي­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر اين، روش­هاي ايمنولوژيك مانند الايزا وIMS نيز براي شناسائي سالمونلا توسه يافته­اند.

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با اين­حال اختصايت كم و هزينه­هاي بالا، بهره گیری ازين روش­ها را محدود كرده می باشد. اخيرا روش­هاي مولكولي مانند PCR و real time PCR به­گونه گسترده در شناسائي سالمونلا بهره گیری مي­شوند كه روش­هايي كارآمد و حساس هستند.

Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

     با اين­حال اين روش­ها نيازمند سيكل حرارتي اختصاصي و دستگاه­هاي گران­قيمت­اند. از­اين­رو نياز به يك روش دقيق، حساس، آسان و به­صرفه­تر می باشد. در سال 200 يك گروه ژاپني يك روش تشخيص مولكولي به نام LAMP را معرفي كردند .(Notomi et al., 2000)از آن وقت روش LAMP به عنوان يك روش اختصاصي، حساس و سريع براي شناسائي پاتوژن­هاي ناشي از مواد غذائي مورد بهره گیری می باشد. يك روش ساده، بدون نياز به سيكل حرارتي اختصاصي و دستگاه­هاي گران­قيمت و به آساني قابل اجرا می باشد(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).

     هدف اين تحقيق شناسائي باكتري سالمونلا تيفي در سالاد سبزيجات و سس مايونز آلوده با بهره گیری از روش LAMP، به­عنوان روشي سريع، حساس و اختصاصي مي­باشد.

اهداف پژوهش در نگاه اجمالی

1. طراحي و بهينه­سازي روش LAMP بر اساس ژن تهاجمي invA سالمونلا تيفي
2. تعيين حد حساسيت روش PCR و LAMP به روي ژن تهاجمي invA سالمونلا تيفي
3. مقايسه دو روش PCR و LAM

• مشخصات جنس سالمونلا

1-1-2- تاريخچه

در سال 1885 يك دامپزشك آمريكائي به نام دانيل المر سالمون براي اولين بار اين باكتري را از خوك جدا كرد وآن را باسيلوس كلرا­سوئيس[1] ناميد. در سال 1888 جرم ديگري توسط گارتنر از فردي كه در اثر گاستروانتريت ناشي از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا گردید و آن­را باسيلوس انتريتيديس ناميد كه بعداً سالمونلا انتريتيديس خوانده گردید. در سال 1900 خواص اين باكتري توسط فردي به نام لينير به­گونه رسمي تصويب گرديد. از آنجا كه اين ارگانيسم ها شبيه به باكتري هاي جدا شده توسط سالمون بودند، به همين جهت به افتخار كاشف اوليه اين باكتري سالمونلا[2] ناميدند(Roumagnac et al., 2006).

     در فاصله بين سال­هاي 1925ـ1900 بزرگ­ترين رويداد در كشف سرولوژيكي آنتي‌ژن‌هاي سوماتيك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسيله ليگنيرز انجام گردید. در سال 1926 تركيبات پادگني سالمونلا طبقه‌بندي گرديد و جدولي به نام جدول كافمن ـ وايت ايجاد گردید. در حال حاضر اين جدول داراي حدود 2500 سروتيپ می باشد (Bhatia & Nabb , 1980) .

     سالمونلا بطور گسترده در طبيعت توزيع شده می باشد مانند آب آلوده، خاك حاوي مدفوع حيوانات و غيره. به طور عمده اين باكتري­ها در روده­ي حيوانات ساكن می باشد و مخزن اصلي آلودگي مرغ، تخم مرغ، دام، حيوانات خانگي و خزندگان می باشد(Cidrp, 2009).

 2-1-2- خواص شكلي

اعضاي جنس سالمونلا باكتري­هاي ميله­اي شكل و اندازه­ي آن 5-2 ´5/1-7 /. ميكرون بوده می باشد.گرم منفي، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ي انتروباكترياسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضاي اين جنس متحرك و با تاژه­ي پري­تريش­اند به­غیر از چند مورد استثناء مانند سالمونلا گاليناروم[3] و سالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بيوشيميايي

اعضاي اين جنس قادر به تخمير گلوكز بوده ولي از تخمير ساكارز و لاكتوز نا­توانند. بيشتر انواع سالمونلا ها گلوكز، مالتوز، مانيتول، دولسيتول، دكسترين و سوربيتول را تخمير مي كنند و اسيد و گاز به وجودمي آورند. اكثر سويه­ها H₂sرا از منبع سولفوري معدني توليد كرده و تولید H₂S یکی از واکنش هاي کلیدي در تشخیص سالمونلاها مي­باشد. به استثنای سروتیپ تیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد مي­کنند. در سيترات به عنوان تنها منبع كربن رشد مي­كنند اما بعضی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). اين باكتري اكسيداز منفي و كاتالاز مثبت بوده. از توليدات اين باكتري ليزين در كربوكسيلات، سولفات هيدروژن وارنيتين مي‌باشد.

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

   از ديگر ويژگيهاي بيوشيميايي اين می باشد كه اكثر سالمونلاها عدم توليد اندول، عدم توليد آنزيم‌هاي اوره آز،   ليپاز، دزاكسي ريبونوكلئاز، فنيل‌آلانين و تريپتوفان دآميناز، دكربوكسيلاسيون اسيدهاي آمينه ليزين، اورنيتين و آرژنين، واكنش مثبت در آزمايش متيل‌رد(MR) و واكنش منفي در آزمايش وژس ـ پروسكوئر (VP) مثبت مي‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

 4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فيزيكي و شيميايي

اين باكتري روي محيط كشت ماهها زنده مي­مانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقيقه تحمل مي­كنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشه­هاي آلوده نگهداري شده در يخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاك باغچه و مدت بسيار طولاني در شيرخشك­هاي بدون چربي و موادغذايي داراي تخم مرغ زنده مي­مانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و يخ زنده مانده واز اين طريق مي­توانند اپيدمي به­وجود آورند. كلرامنفيكل استرپتوميسين و بسياري از آنتي بيوتيك هاي وسيع الطيف بر آن موثرند پني سيلين بر آن كاملا بي­اثر می باشد. سالمونلاها همچنين نسبت به املاح صفراوي مقاومند وبه همين دليل از اين مواد نيز علاوه بر رنگ­ها در تهيه محيط‌هاي غني‌كننده بهره گیری مي‌كنند Aksoy, 2004)).

 5-1-2- خواص كشت

اعضاي اين جنس هوازي بي­هوازي اختياري مي­باشند. مزوفيل بوده و رشد بهينه­ي آن در دماي 37درجه می باشد.با اين­حال برخي از سالمونلا­هادر شرايط شديد زيست محيطي مانند درجه حرارت بالاي 54 درجه و سرماي 4-2 درجه را تحمل كنند. pH مناسب براي رشد آن 5/7-5/ 6 مي باشد اما pH حدود 9- 5/4  را مي تواند تحمل كند و اگر pH پائين­تر از 4 برود باعث از بين رفتن ميكرو­ارگانيسم مي­گردد. pH بيشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگيري مي­كند. غلظت نمك 3/ 5 % بالاتر عاملي در جهت جلوگيري از رشد و تكثير باکتری می باشد (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).

     اکثر سالمونلاها در روی آگار مغذی بعد از 24 ساعت پرگنه هایی به قطر 3-2 میلی متر و به رنگ سفید، خاکستری، مرطوب ،کروی، مسطح، برجسته و صاف ایجاد می کنند. اندازه و درجه کدورت پرگنه ها به نوع سروتیپ بستگی دارد. سالمونلاها در محیط های مایع نظیر آبگوشت مغذی و آب پپتونه رشد زیادی دارند Jay et al., 2005)).

     انواع محيط‌هاي غني كننده مي‌توان به آبگوشت تتراتيونات آبگوشت سلنيت F، آبگوشت را پاپورت (حاوي كلريدمنيزيم و سبزمالاشيت) و آبگوشت سلنيت سيستين تصریح كرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محيط‌هاي غني كننده روي محيط‌هاي انتخابي جامد كشت مي‌دهند. از محيط‌هاي انتخابي و تفريقي مي‌توان به محيط مك‌كانكي و محيط سالمونلا ـ شيگلا، محيط سبز درخشان، محيط آهن ليزين‌دار، محيط داكسي كلات سيترات يا محيط ليفسون(DCA)، محيط هكتوئن و محيط داكسي كلات ـ ليزين ـ گزيلور تصریح كرد. محيط بيسموت سولفات آگار، نيز به عنوان محيط انتخابي براي جداسازي سالمونلا مورد بهره گیری قرار مي‌گيرد چرا كه قدرت انتخابگري اين محيط بالاست. اين باكتري‌ها معمولاً كربوهيدرات را با توليد اسيد و گاز تخمير مي‌كنند.

. (D’ Aoust , 1991 ; D’ Aoust , 1998 ; Connie & Manuselis, 2000 ; Ferretti , 2001)

6-1-2 شرايط رشد سالمونلاها

سالمونلاها قادرند در محيط‌هاي ساده آزمايشگاهي رشد نمايند و از تركيبات ساده كربن‌دار به عنوان منبع كربن و انرژي و از تعداد زيادي از تركيبات ازت به عنوان منبع نيتروژن بهره گیری كنند (D’Aoust , 1998).

اكثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در ميحط حداقل نمك با يك منبع كربن مناسب و يا محيط حداقل آمونيوم ـ گلوكز توانايي رشد دارند .(Morse, 1988)اكثر سويه‌هاي سالمونلاتيفي جهت رشد احتياج به اسيد آمينه تريپتوفان دارند. رشد سالمونلاها در دامنه حرارتي 5 تا 47 درجه می باشد ولي دماي اپتيمم 37 درجه می باشد .(D’ Aoust , 1991)

     بعضي از گونه‌هاي سالمونلا درجه حرارت‌هاي بالاتر از c ْ54 را نيز تحمل مي‌كنند و عده‌اي ديگر خواص سرما دوستي را بوسيله رشد كردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌هاي پائين امكان رشد و بقاي سالمونلا بيشتر می باشد. گزارش شده كه سالمونلاها نسبت به خشكي حساسند از اين­رو انتشار آن­ها از طريق گرد و غبار و ذرات خشك كمتر از آب و مواد غذايي مرطوب می باشد. بقاء سالمونلاها به گونه نسبي به درجه حرارت محيط وابسته می باشد .(Davis , 1996) به طوريكه در 55 درجه سانتي‌گراد در عرض يك ساعت و در 60 درجه در مدت 15 دقيقه نابود مي‌شوند.

     پاستوريزاسيون شير باعث از بين رفتن سالمونلاها مي‌گردد. شير به مدت 3ـ2 ثانيه در 66 درجه سانتي‌گراد، تخم‌مرغ به مدت 10 دقيقه در 55 درجه سانتي‌گراد و گوشت به مدت 10ـ15 دقيقه در 65 درجه سانتي‌گراد معمولاً عاري از سالمونلاي زنده خواهند گردید .(Alcamo , 1997)

   رشد سالمونلا بوسله منابع مختلف كربن و نيتروژن تنظيم مي‌گردد. اندازه باكتري و ميزان متوسط اجسام نوكلئوزيدي هر دو مستقيماً به ميزان رشد وابسته‌اند. حساسترين معرف تغيير در ميزان رشد، RNA ريبوزومي می باشد. به غیر از مواردي كه ميزان رشد بسيارپائين می باشد، ميزان ريبوزوم‌ها درهر ميلي‌گرم پروتئين‌ با ميزان رشد متناسب می باشد. به دنبال افزايش سنتز RNA به آرامي ميزان سنتز پروتئين و DNA نيز افزايش مي‌يابد. اين مسأله به دليل تأثیر تنظيمي RNA در سنتز تركيبات يافته‌اي می باشد. آب نمك با غلظت بيش از 10% اثر كشندگي روي باكتري سالمونلا دارد   .(D’ Aoust , 1991 ; Quinn , 1994)

 7-1-2- بقا سالمونلا

بقاي سالمونلاها در محيط تحت‌تأثير عوامل مختلفي می باشد. گزارش شده كه سالمونلا دابلين در زمستان حداقل به مدت 73 روز و در تابستان 119 روز در مدفوع زنده مي‌ماند. بنا به تحقيقات بقا سالمونلاتيفي موريوم در چراگاه و خاك و بسته حدود 200 روز تخمين زده شده می باشد(.(Connie & Manuselis , 2000

بقاء سالمونلاها به گونه نسبي به درجه حرارت محيط وابسته می باشد به طوري‌كه سالمونلاتيفي موريوم و سالمونلا كلراسيس در c ْ29 به ترتيب 4 و 9 روز و در c ْ60 به مدت 25 و 38 روز زنده مي‌مانند. مقاومت به حرارت در مورد سالمونلايي كه در يك محيط غني از مواد مغذي رشد مي‌كنند و يا در محيطي با a_w كم هستند بيشتر از آنهايي می باشد كه در يك محيط فقيرند. بررسي‌ها نشان داده كه اگر سالمونلا تيفي موريوم در معرض محيط اسيدي ملايم (6 – 5/5) قرار گيرد سلول تا pH > 5/4 را تحمل مي‌كند Foster , 1995)).

 8-1-2- زيستگاه

سروتيپ­هاي جنس سالمونلا از مهم­ترين باكتري­هاي ميله­اي گرم منفي، عامل التهاب ­هاي روده­اي حاصل از مواد غذائي می باشد كه با منشا انسانى و حيوانى پراكنش وسيعى در طبيعت دارند. زيستگاه اصلي سروتيپ­هاي سالمونلا، روده جانوراني همانند پرندگان، خزندگان، جانوران مزرعه­ا ي و بشر مي­باشد .مي­تواند از ماهي و لاك­پشت نيز به­گونه مستقيم انتقال يابد. انتشار این باکتری از حیوان به حیوان دیگر و بهره گیری از مواد غذایی دامی آلوده به سالمونلا توجیه کننده این مطلب می باشد که حیوانات به عنوان مخزن باکتری می­باشند MIRZAIE,2010)).

   اين ارگانيسم­ها از طريق مدفوع دفع شده و مى­توانند موجب آلوده شدن آب­­هاگردند. مصرف آب­هاي آلوده و مواد غذايي آلوده شده توسط حشرات يا ديگر واسطه­ها به­وسيله بشر و ساير جانوران موجب تكرار چرخه آلودگى مى­گردد. تكرار اين چرخه از طريق تبادلات بين­المللي فرآورده­هاي جانوري و خوراك دام عامل عمده انتشار جهاني سالمونلوزيس می باشد .

تعداد صفحه :128

قیمت : چهارده هزار و هفتصد تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ———-        [email protected]